其次是葡人失去了马六甲贸易中转站。葡萄牙东方贸易的繁荣局面，是依靠强大的舰队控制着由里斯本～好望角～果阿～马六甲～澳门、长崎、马尼拉的航线安全作为保证的。如果丧失了对这条海上贸易线的控制权，商船航行不安全，就不可能再有贸易的霸权。 马六甲位于从印度洋进入南海的海上交通要道，具有非常重要的战略意义。葡人自从1511年占领以后，这里便成为葡萄牙分舰队的基地，以及海上商船队的中途补给点和转运站。澳葡商船往返里斯本和印度期间，总在马六甲港停留。然而从16世纪末以后，荷兰东印度公司亦向远东扩张，侵入印尼群岛。并联合马来半岛中与葡萄牙敌对的亚齐、柔佛等国攻击葡萄牙舰队，严重威胁葡萄牙人在马六甲海峡的贸易垄断权。葡萄牙人传统的贸易航线再也不安全了，这也直接影响澳门同这个地区，以及香料群岛、果阿和里斯本的贸易。1631年底，澳门总督施维拉率领的一支由6艘船组成的商船队，满载货物航行至马六甲海峡时， 遭到荷兰舰队的阻击，5艘商船被荷兰人俘获，另1艘受重创，不久沉没。总计损失达100 万歇勒芬（注：博克萨：《葡萄牙绅士在远东》海牙1948年版，第107页。）到1636年， 葡萄牙商船通过马六甲海峡更加困难，而马六甲城的葡萄牙人也因为荷兰的封锁在经济上陷于困境，胡椒、锡、丁香等货源枯竭，使马六甲失去了贸易中转港的地位。 1640年6月，荷兰巴达维亚总督率领一支由1500 人组成的远征队闯入马六甲海域，封锁海峡，袭击港口。葡萄牙人寡不敌众，终于在1641年1月全城投降，荷兰人终于从葡萄牙人手里夺取了马六甲， 加固城堡，实行贸易垄断制。荷兰舰队在海峡巡逻，强制外国商船在马六甲停泊交税，领取通行证。从此，荷兰取代葡萄牙，成为东方海权新霸主。澳葡商人虽然获准继续前来马六甲贸易，但规模与实力已大不如前了。 第三是葡萄牙商人又被逐出长崎。本来葡人在长崎的贸易受到日方极大的优待，如葡人与日人之间发生民事或刑事纠纷时，葡方罪犯可不交日本当局处置，而由葡方中日贸易舰队司令加以惩办；舰队司令访问幕府将军时，可以享受大名即地方封建主一样的礼遇；舰队司令还可以在京都开设常驻办事机构，派出一名常驻代表与日本当局保持联系，传递信息，等等（注：博克萨：《澳门来的大船》，第8页。）。 但是澳葡对日贸易的厄运也终于来到了。17世纪30年代以后，双方贸易处于下降趋势。1636年，贸易额下降到了最低点。这一年出口额为白银235 万日本两，只相当于鼎盛时期的一半左右。主要由两个因素造成：一是日本幕府看到葡萄牙天主教势力在日本的影响不断扩大，并且参与日本国内的政治斗争，而对葡人产生猜忌；二是17世纪以后，西方国家，尤其是荷兰，也先后来到日本进行贸易活动，削弱了葡萄牙人在日本的贸易地位。二者当中，尤以前者对葡人的贸易造成更为不利的影响，到后来，竟然导致葡人的被逐。 葡萄牙传教士随同商船前来日本，人数不断增加，传教活动不断扩大。1600年日本天主教徒已达75万人之多，这在当时绝不是一个小数字。日本人中也出现了神父和修道士（注：井上清：《日本历史》上册，第328页。）。 日本幕府愈来愈认识到天主教是日本专制统治的障碍。但为了海外贸易的利益，起初还是采取比较宽容的态度对待葡萄牙传教士。可是后来信奉新教的荷兰人为了挤进日本市场，取代葡人的贸易地位，便向日本幕府大进谗言，说葡萄牙天主教士怀有征服日本的企图。于是幕府对葡萄牙传教士的戒心愈来愈重，认为传教士排斥神道和佛法，毒化了日本国民的灵魂。1612年，发现德川幕府的亲信中也有人加入天主教，幕府将军大为震惊。第二年（1613），便下令全国禁止天主教。随之澳葡与日本长崎的贸易也开始发生危机。因为日本人认为，只要允许澳葡继续到长崎贸易，就一定会有葡人传教士混入日本，造成祸害。1635年，幕府宣布严禁日本人进行海外贸易和驻留他国，违者处以死刑。同时，也禁止外国商船挟带传教士前来日本港口，违者船货全部没收。1637年，日本岛原、天草等地的天主教徒举行武装暴动，反对宗教压制。幕府费了很大力气，并在荷兰人助攻之下，才把暴动镇压下去。幕府怀疑暴动受到葡人的唆使，猜忌之心日益加重。恰好这时候，又发生了所谓澳葡企图干预日本内政的事件。这一事件终于使澳门与长崎之间的贸易遭到了致命的打击。 1636年，荷兰人把一封葡人莫罗致西班牙国王的信送交日本长崎当局。荷兰人声称，这封信是在好望角海域截获的一艘葡人商船上发现的。莫罗是当时在日本的葡人领袖，此信的内容是莫罗向国王报告，日本的暴动者企图与葡人一起推翻幕府的统治。幕府当局后来又查获莫罗另一封写给澳门葡萄牙自治机构的信，内容与前信大致相同。这两封信决定了葡萄牙商人在日本的厄运。1639年，日本幕府颁布锁国令，宣布全面实行闭关政策，除与中国、朝鲜和荷兰三国通商之外，禁止其他国家在日本贸易。三国当中，中国与朝鲜是日本近邻，有着传统的贸易关系；而荷兰之所以特准贸易，是因为荷兰人帮助幕府镇压了教徒暴动，立下了汗马功劳，获得幕府信任。实际上，锁国令主要是针对葡萄牙人的。此令一出，所有居留长崎等地的葡商及其家属、奴仆等均被逐回澳门。幕府还规定，任何人若偷偷回到长崎，或带信回长崎，一经查出，全家一起处死（注：张天泽：《中葡通商研究》，第137～138页。）。 澳葡对失去惨淡经营起来的长崎贸易基地很不甘心，1640年，他们派了一个4人代表团前往日本，恳求恢复贸易。但他们刚刚抵达日本， 便被幕府抓起来砍头示众。随行人员幸免一死，被逐回澳门。这些人带回一封幕府致澳门葡人自治当局的信，信中说：“无论是葡萄牙国王本人，还是基督教的上帝，如果胆敢擅自践踏幕府主权，便将会遭到同样（被砍头）的下场。”（注：张天泽：《中葡通商研究》，第137～138页。）
